Poznámka: Nasledujúci článok bol zahrnutý medzi ďalšie konvenčné terapie, pretože samostatná časť zatiaľ nie je k dispozícii pre experimentálne metódy molekulárnej biológie mimo humánnej medicíny. Metóda CRISPR / Cas je molekulárno-biologická metóda na cielené rezanie, ako aj modifikáciu DNA (úprava genómu; gen nožnice). V roku 1987 vedci objavili predtým nepozorovaný adaptívny imunitný systém v E. coli. Toto je založené na takzvaných CRPSPR sekvenciách (zoskupených pravidelne s medzipriestorom, krátkych palindromických repetícií) v DNA. E. coli integruje DNA bakteriofágov (skupiny vírusy ktoré sa špecializujú na baktérie ako hostiteľské bunky) sekvenciu CRSPR vlastnej DNA, čím prepisuje crRNA (prepis DNA na RNA). CrRNA pozostáva z spacerovej aj opakovacej sekvencie. Dištančné sekvencie sú sekvencie „extrahované“ z baktérie. Takzvaná trRNA (tracrRNA) sa viaže na pomenované opakované sekvencie. Prijíma enzým CAS9. Teraz je prítomný komplex - komplex crRNA: tracrRNA: Cas9 - ktorý je schopný viazať bakteriofágovú DNA komplementárnu s vesmírnymi sekvenciami crRNA. Ako takzvaná endonukleáza (enzým štiepiaci DNA, teda reštrikčný enzým), CAS9 štiepi vírusovú DNA dvojvláknovým spôsobom, čo nakoniec vedie k neschopnosti replikácie (tj. Žiadna ďalšia replikácia a následne žiadna ďalšia integrácia). Už viac ako desať rokov sa tento postup používa s dôrazom na výskum úpravy genómu. Popísaný „crRNA: tracrRNA: komplex Cas9“ je univerzálne použiteľný pre rastliny a živočíchy a umožňuje odstránenie (vypustenie) a konečné umlčanie génov. Už viac ako 5 rokov sa zistilo použitie v poľnohospodárstve a potravinárskych plodinách na toleranciu sucha, ako aj na zvýšenie imunizácie proti vírusovým patogénom. Tento postup by sa možno mohol neskôr použiť v humánnej medicíne. Od roku 2020 prvýkrát existuje liečebný terapeutický prístup k ochoreniu s vrodeným ochorením srdce defekt (vitium) u detí. Vírus je súčasťou komplexnej dedičnej choroby Noonanov syndróm (autozomálne recesívne alebo autozomálne dominantné dedičstvo). Po dešifrovaní kauzálnych variantov LZTR1 gen, vhodná génová korekcia generovaných indukovaných pluripotentných kardiomyocytov (srdce svalové bunky) z kmeňových buniek dvojčiat. The gen reguluje základné signálne dráhy pre diferenciáciu a rast buniek.
Pred touto potenciálnou liečbou v humánnej medicíne
Molekulárne genetické testovanie na dedičné poruchy u rodičov vrátane komplexného genetické poradenstvo.
postup
Postup je obdobný ako v prípade obranného mechanizmu E. coli opísaného v imunitný systém. V tomto procese môže byť dištančná časť crRNA modifikovaná tak, aby štiepila sekvenčne špecifickú dvojvláknovú komplementárnu DNA, čo vedie k cieleným deléciám. Chemicky modifikovaná molekula trRNA: crRNA sa nazýva guideRNA. To si vyžaduje, aby sa dva rôzne komplexy crRNA: tracrRNA: Cas9 pripojili k dvom miestam na DNA. Po odstránení fragmentu DNA dôjde pomocou ligáz k väzbe 2. fragmentov DNA pomocou enzýmu. To sa líši od samotného rozrezania sekvencie DNA ako v baktérii. V priebehu rokov boli pridané základné techniky modelovania. Umožňujú nielen delécie v reťazci DNA, ale aj adíciu (inzerciu) nových nukleotidov DNA. Najsľubnejšou úpravou je prime editing. Tu nasleduje po delécii a teda odstránení fragmentu DNA inzercia nového fragmentu DNA. Ako prepis DNA, ktorá sa má vložiť, je tu k dispozícii takzvaná pegRNA (hlavná editačná príručka RNA). Pomocou reverznej transkriptázy sa pegRNA transkribuje do DNA a inkorporuje sa do DNA, opäť pomocou ligáz. Proteín CAS9 požadovaný pre tento proces generuje jednovláknové namiesto dvojvláknových rezov. To umožňuje, aby bol nový fragment DNA vložený s presným uložením do vyrezaného reťazca DNA s jeho vyčnievajúcimi koncami. Nová modifikácia je zásadná pre výmenu „patologickej“ sekvencie DNA za „nepatologickú“ v budúcnosti v súvislosti s dedičným ochorením.
Po terapii
Opäť sa vykonáva skríning genómu, aby sa potvrdila úspešnosť úpravy genómu.
Možné komplikácie
Kvôli možnému nesúladu báz GuideRNA sa môžu vyskytnúť mimotelové účinky, tj väzba na nežiadúcom mieste. Môžu spôsobiť bodové mutácie (zmeny báz), inzercie (začlenenie ďalších nukleotidov alebo sekvencií DNA do sekvencie DNA), delécie (strata ...), translokácie (zmena polohy DNA) a inverzie (prítomnosť segmentu DNA obráteného 180 stupňov). Enzým CAS9 sa nereže na požadovanom mieste vo všetkých prípadoch. Zvýšenie špecifičnosti sa však už dosiahlo zmenami v dizajne proteínov. Tiež pripojením CAS9 k endonukleáze Fokl, tiež odvodenej z baktérie, špecificita sa mohla zvýšiť na 1: 10,000 1 (bez ďalších úprav, iba špecificita do 2: XNUMX).
