In situ hybridizácia je metóda na zisťovanie chromozomálnych aberácií. Zahŕňa konkrétne označovanie chromozómy s múčnatkou farbivá a ich naviazanie na sondu DNA. Táto technika sa používa na prenatálnu diagnostiku genetických mutácií.
Čo je hybridizácia in situ?
Hybridizácia in situ zahrnuje špecifické značenie chromozómy s múčnatkou farbivá a ich naviazanie na sondu DNA. Táto technika sa používa na prenatálnu diagnostiku gen mutácie. Hybridizácia in situ alebo fluorescenčná hybridizácia in situ zahŕňa molekulárno-genetickú detekciu nukleové kyseliny z RNA alebo DNA v špecifických tkanivách alebo bunkách. Normálne sa tento typ diagnostiky používa na detekciu štrukturálnej alebo numerickej chromozomálnej abnormality v tehotenstva. Na tento účel sa používa umelo vyrobená sonda, ktorá sama pozostáva z nukleovej kyseliny. Potom sa viaže na nukleové kyseliny v organizme párovaním báz. Táto väzba sa označuje termínom hybridizácia. Detekcia sa vykonáva na živej štruktúre pacienta, a preto zodpovedá detekcii in situ. Od toho je potrebné odlíšiť metódy in vitro, pri ktorých sa detekcia uskutočňuje v skúmavke. Metódu vyvinuli v 20. storočí vedci Joe Gall a Mary Lou Pardue. Odvtedy sa táto technika vyvinula. Napríklad keď sa potom používali rádioaktívne sondy, sondy značené fluorescenciou s kovalentnou väzbou k značeniu molekuly sa dnes používajú.
Funkcia, účinok a ciele
In situ hybridizácia sa zvyčajne používa na detekciu chromozomálnych aberácií, chromozomálnych abnormalít, ktoré sa nedajú zistiť na karyograme. Metóda sa teda používa vždy, keď sa majú v priebehu určovať dedičné choroby tehotenstva. Pretože chromozomálne aberácie sú problémom, ktorý by sa dnes nemal podceňovať, aplikácia metódy časom narástla. Hybridizácia sa uskutočňuje pomocou natívnych buniek z matky plodová voda. Základom tejto techniky je väzba farebne označenej sondy na fragmenty DNA. Vďaka väzbe možno neskôr na vyhodnotenie počtu kópií použiť mikroskop, pretože jednotlivé kópie vysielajú svetelný signál a môžu byť tak zviditeľnené pod mikroskopom. Existujú rôzne postupy. Analýza sa uskutoční okamžite po väzbe. V tomto prípade sa použije fluorescenčné farbivo ako napr biotín sa používa priamo na DNA sondu. Pri nepriamej metóde in situ hybridizácie nemožno analýzu vykonať bezprostredne po hybridizácii, pretože fluorescenčné látky sa môžu na sondu viazať až po hybridizácii. Táto nepriama metóda sa používa častejšie ako priama metóda, pretože sa považuje za citlivejšiu. Medzi techniky patria chromozómovo špecifické centrometrické sondy DNA, lokusovo špecifické sondy DNA, chromozómovo špecifické sondy knižnice DNA a komparatívne hybridizácie genómu. Na detekciu chromozomálnych numerických abnormalít možno použiť chromozómovo špecifické centromérové sondy DNA. To znamená, že sa primárne používajú pri duplikovaní alebo odstránení chromozómy sú podozriví. Lokálne špecifické sondy DNA sú vhodné hlavne na detekciu minimálnych mutácií, ktoré sa nedajú zistiť na karyograme. Sonda knižnice DNA špecifická pre chromozómy sa používa najmä na detekciu inzercií a translokácií. Porovnávacia genómová hybridizácia je na druhej strane komplexnou analýzou strát a prírastkov chromozomálneho materiálu. V súčasnosti má hybridizácia in situ veľký význam v diagnostike rôznych chromozomálnych mutácií. V diagnostike Downov syndrómnapríklad sondy sa viažu na chromozóm 21. Na tento účel sa zvyčajne používajú sondy špecifické pre chromozómy, ktoré je možné použiť v prípade podozrenia na túto chorobu. Podozrenie môže vzniknúť napríklad vtedy, ak rodičia predtým porodili dieťa s touto chorobou a ultrazvuk obraz je nápadný. Ak dôjde skôr k trojitému ako dvojitému viazaniu, čo vedie k trojitému farebnému signálu, diagnóza sa považuje za potvrdenú.
Riziká, vedľajšie účinky a nebezpečenstvá
Na rozdiel od PCR je napríklad hybridizácia in situ oveľa menej náchylná na kontamináciu. Okrem toho je čas potrebný na postup nesmierne kratší. Pretože najmä embryá tvoria chromozomálne obrazce, nie je možné použiť akýkoľvek prítomný obrazec, aby sa s istotou odvodil zvyšok chromozomálnych obrazcov. distribúcia a tým aj genetický stav ostatných buniek. Farebné signály sa tiež môžu prekrývať alebo zostať neviditeľné z iných dôvodov. Teda hybridizácia in situ ako diagnostický nástroj počas tehotenstva je pomerne náchylný na chyby. Môžu sa vyskytnúť nesprávne diagnózy a rodičia sa môžu rozhodnúť proti zdravému embryo. Aby sa znížila náchylnosť na hybridizáciu in situ, mali by sa súčasne vyšetriť najmenej dve embryonálne bunky. Pri paralelnom vyšetrení dvoch buniek existuje v súčasnosti iba zanedbateľné riziko nesprávnej diagnózy. Rodičia sa preto v takom prípade môžu spoľahnúť na diagnózu. Hybridizácia in situ sa neponúka každej tehotnej žene, ale iba ženám z rizikovej skupiny. Tehotným ženám sa však tento typ diagnózy neodmieta na vlastnú žiadosť. Nenormálne ultrazvuk nálezy alebo abnormálne sérum môžu vyzvať lekára, aby ponúkol diagnostický postup. Dnes je možné in situ hybridizáciu použiť na diagnostiku veľkého podielu chromozomálnych aberácií, ale v žiadnom prípade nie všetkých. Hybridizácia in situ sa preto nikdy nesmie uskutočňovať samostatne, ale musí sa vždy používať v spojení s konvenčným testom na chromozómy. Pri tomto postupe zohráva hlavnú úlohu starostlivosť o tehotnú ženu. Pred analýzou preto prebehne s budúcou matkou dôkladná diskusia o diagnostickej metóde, ktorá ju informuje o rizikách, možnostiach a obmedzeniach tejto techniky.
