Polymerázová reťazová reakcia predstavuje postup z molekulárnej biológie, ktorý duplikuje rezy z genetického materiálu (deoxyribonukleová kyselina, DNA). Z minimálneho množstva DNA sa vyprodukujú milióny rovnakých kópií. Týmto spôsobom sú k dispozícii množstvá dostatočné na rôzne vyšetrovania.
Čo je to polymerázová reťazová reakcia?
Polymerázová reťazová reakcia predstavuje metódu z molekulárnej biológie, ktorá duplikuje rezy z genetického materiálu (deoxyribonukleová kyselina, DNA). Pojem polymerázová reťazová reakcia (PCR) popisuje reakciu in vitro (latinsky: in the glass) pomocou enzýmu, polymerázy (DNA polymerázy), ktorá vedie k duplikácii určitých gen sekvencie. Produkt reakcie je tiež východiskovou látkou pre nový cyklus tejto reakcie. Počet molekuly zdvojnásobí a zároveň slúži ako šablóna pre nový cyklus. Toto sa označuje ako exponenciálne násobenie. Prebieha v laboratóriu veľkou rýchlosťou niekoľkých minút, podobne ako pri reťazovej reakcii. Tento laboratórny proces napodobňuje duplikáciu genetickej informácie (DNA), ku ktorej dochádza v prírodných podmienkach počas replikácie. Za objaviteľa tohto procesu je považovaný americký chemik KB Mullis. V roku 1983 zaviedol tento proces syntézy DNA a o desať rokov neskôr získal Nobelovu cenu za chémiu.
Funkcia, účinok a ciele
V živých organizmoch je DNA v chromozómy má dĺžku, ktorú nie je možné amplifikovať pomocou PCR. Namiesto toho sa aplikuje na zosilnenie definovaného úseku. Môžu to byť gény, špecifická súčasť a gen, alebo oblasti, do ktorých sa nepripisuje proteínytj nekódujú sa. Tieto sekcie zvyčajne neobsahujú viac ako tri tisíc párov báz, v porovnaní s približne dvakrát troma miliardami párov báz na sadu chromozómy u ľudí. Polymerázová reťazová reakcia vyžaduje jedno alebo dvojvláknový reťazec DNA, ktorého štruktúra musí byť aspoň čiastočne známa. Okrem enzýmu, polymerázy, sa používajú dva primery. Jedná sa o stavebné kamene DNA, ktoré slúžia ako počiatočný a konečný bod. Vyznačujú sa sekvenciou, ktorá sa presne zhoduje s oblasťou, ktorá sa má amplifikovať. V laboratóriu sa polymerázová reťazová reakcia uskutočňuje v programovateľnom vyhrievacom bloku. Potrebné komponenty, ako je polymeráza, základný náter, stavebné prvky na výrobu nového reťazca (deoxyribonukleozid trifosfáty) a magnézium ióny sa pridajú dohromady v tlmivom roztoku. Teplotno-časový program pre reakciu začína denaturáciou pri teplote nad 94 ° C. V tomto procese sa dvojvláknová DNA štiepi a je prítomná v jednovláknovej forme. V ďalšom kroku, asi pri 70 ° C, je primér naviazaný na gen sekvencia a tvorí východiskový bod pre enzýmovú reakciu. Odtiaľto polymeráza syntetizuje komplementárne vlákno. Potom sa začína nový cyklus, ktorý sa opäť skladá z troch krokov denaturácie, väzby primerov a syntézy reťazca DNA. Polymerázová reťazová reakcia sa používa v súdnom lekárstve, klinickej diagnostike a klinickom výskume. Vo forenznej vede sa DNA extrahuje z koža, slina, vlasy, sperma alebo krv z miest činu a po zosilnení porovnané so známymi vzorkami a použité na identifikáciu konkrétnych osôb. Použitím tohto genetického odtlačku prsta možno otcovstvo objasniť aj v upravenom prístupe. Pri objasňovaní chorôb sa na overenie zapojených génov používa polymerázová reťazová reakcia. Niektoré bakteriálne choroby je možné klasifikovať rozpoznávaním špecifických sekvencií. Vírusové choroby možno charakterizovať transformáciou a amplifikáciou vírusovej DNA alebo RNA. V krv skríning, je možné zistiť zápal pečene alebo choroby sprostredkované HIV vo veľmi skorom štádiu. V diagnostike nádorov sa používa na identifikáciu nádorových buniek. To umožňuje klasifikovať nádor, posúdiť priebeh ochorenia, úspešnosť terapie a prognóza. Pri výskume sa polymerázová reťazová reakcia používa na identifikáciu génov spojených s rôznymi chorobami. Pri klonovaní génov, ktoré nie je to isté ako klonovanie organizmu, sa gén amplifikuje pred prenosom do iných organizmov vo vektore (latinsky: cestovateľ, nosič) ). Môžu slúžiť ako modely na lepšie štúdium chorôb alebo produkciu proteíny ktoré možno použiť ako drogy.
Riziká a riziká
Polymerázová reťazová reakcia má obrovský potenciál na detekciu nepatrného množstva DNA. Aby bolo možné využiť množstvo možností a chrániť sa pred závažnými chybami, musia sa zohľadniť určité predpoklady a rôzne zdroje chýb. Môžu sa amplifikovať iba časti genetického materiálu, ktorých sekvencia je aspoň čiastočne známa. Touto metódou nie je možné amplifikovať úplne neznáme sekvencie. Produkty zosilnenia môžu byť následne vizualizované. Ak očakávaný signál nie je viditeľný, hoci hľadaná sekvencia bola prítomná, je prítomný falošne negatívny výsledok. Najčastejšie je to výsledok neoptimalizovaných alebo zle optimalizovaných reakčných podmienok. Tieto musia byť určené ako funkcia cieľovej sekvencie. Na tento účel sa testujú rôzne teplotné a časové profily, sekvencie primérov a množstvá, ako aj koncentrácie ďalších látok v reakčnej zmesi. Falošné pozitívne výsledky sa prejavia ako signály, ktoré nemožno priradiť požadovanému produktu. Hlavné problémy sú spôsobené kontamináciou DNA pochádzajúcou od výskumného pracovníka alebo z iného zdroja, ako je ten, ktorý sa má analyzovať. DNA bakteriálneho pôvodu ovplyvňuje aj výsledok polymerázovej reťazovej reakcie. Použitím rukavíc a zvýšenou opatrnosťou je možné týmto chybám zabrániť a formulovať spoľahlivé závery o zosilnených výrobkoch.
