Technika patch-clamp je názov pre metódu elektrofyziologického merania. Umožňuje merať iónové prúdy jednotlivými kanálmi v plazmatickej membráne.
Aká je technika patch-clamp?
Technika patch clamp alebo metóda patch clamp patrí do elektrofyziológie, čo je odvetvie neurofyziológie zaoberajúce sa elektrochemickým prenosom signálov v nervový systém. Pomocou tejto metódy je možné vizualizovať jednotlivé iónové kanály v bunková membrána telovej bunky. Zahŕňa to meranie prúdov niekoľkých pikoampérov. Techniku patch-clampu prvýkrát opísali v roku 1976 nemecký biofyzik Erwin Neher a nemecký lekár Bert Sakmann. Obom vedcom bola v roku 1991 udelená Nobelova cena za fyziológiu alebo medicínu za vývoj techniky svorkových náplastí. Elektrofyziologický výskum teda spôsobil revolúciu technikou patch-clamp, pretože otvoril možnosť pozorovania elektrického správania na membráne proteíny jednotlivca molekuly. Termín patch pochádza z anglického jazyka a znamená „patch“. Týka sa to malého membránového úseku pod pipetou náplasti, ktorý sa používa ako meracia elektróda. Počas procesu merania je membránová náplasť fixovaná alebo upnutá (k upnutiu) na špecifikované potenciály.
Funkcia, účinok a ciele
Technika patch-clamp je metóda elektrofyziologickej analýzy. Je založený na biologickom fakte, že bunky majú veľké množstvo pórov a iónových kanálov. V každej bunke a mimo nej sa vyskytujú rôzne koncentrácie alebo náboje iónov, čo závisí od fyziologického stavu bunky. Lipidová dvojvrstva membrány nie je priepustná pre voda molekuly rovnako ako ióny. Napriek tomu k výmene nabitých častíc dochádza cez bunková membrána v nepravidelných intervaloch. Dôvodom je závislosť iónových kanálov od napätia. Ak sa dosiahne určitý membránový potenciál, kanály sa otvoria podľa princípu „všetko alebo nič“. To je presne miesto, kde prichádza technika patch clamp. Týmto spôsobom sa meracia pipeta zavedie do iónového kanálu bez toho, aby prenikla cez bunková membrána. Týmto spôsobom je možné presne určiť miestny elektrický potenciál. Zvodovým prúdom, ktoré by mohli ovplyvniť výsledok merania, sa dá obvykle zabrániť elektricky extrémne tesnými spojmi medzi okrajom pipety a bunkovou membránou. Metóda patch clamp je založená na technike napäťovej svorky. Túto techniku vyvinul v 1930. rokoch americký biofyzik Kenneth Stewart Cole (1900 - 1984) na meranie prúdov v nervových bunkách, ktoré sú neporušené. V napäťovej svorke sa uskutočňuje vloženie dvoch elektród do článku, aby sa zabezpečilo riadiace alebo udržovacie napätie. Súčasne sa používa iná elektróda na zaznamenávanie prúdov, ktoré sa vyskytujú cez membránu. Ak neurofyziológovia chcú vedieť o toku elektrických prúdov konkrétnymi oblasťami a nervová bunka membrány, používajú techniku svorky patch. Používajú na to jemnú sklenenú pipetu, ktorá je umiestnená na vonkajšej strane bunky. Podtlak je možné vytvoriť jeho nasatím pomocou hypodermickej injekčnej striekačky. Tento postup spôsobí, že membrána sa na príslušnom mieste mierne vydúva. Podtlak zaisťuje, že je sklo pripevnené k membráne. To má za následok elektrickú izoláciu malého bodu membrány v pipete od zvyšku membrány. Na meranie elektrických prúdov používajú neurofyziológovia zosilňovač svorkovej svorky. Toto je špeciálne meracie zariadenie. V ideálnom prípade môže vedec pomocou prístroja získať informácie o elektrických vlastnostiach jednotlivých iónových kanálov. Iónové kanály regulujú napríklad prítok a odtok sodík ióny, ktoré sú pozitívne nabité, v nervových bunkách. Vyšetrovanie sa uskutočňuje na bunkách ľudí, rastlín alebo zvierat. Metóda patch-clamp sa zvyčajne vykonáva na meracej stanici, ktorá obsahuje rôzne zariadenia. Na meracom stole tlmenom vibráciami sa nachádza takzvaná Faradayova klietka, ktorá slúži ako elektrický štít. Ďalej je k dispozícii optický mikroskop vrátane mikromanipulátora na uvedenie pipety s náplasťou na miesto. Držiak pipety je navyše pripojený k predzosilňovaču, zatiaľ čo držiak vzorky je pripojený k elektróde v kúpeli. Patch clamp zosilňovač funguje na zosilnenie signálu predzosilňovača. K dispozícii je tiež monitor na sledovanie DUT a pipety s náplasťou. Vo väčšine prípadov je na meracom stole k dispozícii počítač a niekoľko zariadení na ukladanie údajov, ktoré umožňujú digitálny záznam.
Riziká, vedľajšie účinky a nebezpečenstvá
S technikou patch-clamp nie sú spojené žiadne riziká. Napríklad bunky ľudí, zvierat alebo rastlín sa skúmajú až po ich odstránení. Neobmedzený prístup k vonkajšej bunkovej membráne existuje zriedka. Z tohto dôvodu je často potrebné pripraviť bunky na metódu patch-clamp. Po naplnení pipety s náplasťou sa uzavrie do mikromanipulátora. Ten je pripojený k zosilňovaču svorky patch a jemne zatlačený na neporušenú bunku. Postup je možné sledovať pomocou monitora alebo mikroskopu. Pod pipetou je kúsok membrány, ktorá sa nazýva membránová náplasť. Mierny podtlak vytvorený na zadnom konci pipety poskytuje silné spojenie medzi pipetou a membránou. Tento proces vedie k vytvoreniu elektrického odporu medzi externým roztokom a interiérom pipety niekoľkých gigaohmov. Vedci to tiež označujú ako „gigaseal“, čo umožňuje dosiahnuť konfiguráciu metódy patch-clamp pripojenú k bunke. Prúd pretekajúci iónovým kanálom v náplasti tiež preteká obsahom pipety kvôli vysokému gigaseaálnemu odporu. Elektróda pripojená k zosilňovaču je ponorená do roztoku pipety, čo umožňuje merať aktivity jednotlivých iónových kanálov v membráne náplasti.
