Čo je to test PCR?
PCR test je laboratórna metóda používaná v molekulárnej biológii a medicíne. Test sa používa na priamu detekciu – a charakterizáciu – genetického materiálu. Metóda PCR je odborníkmi považovaná za jednoducho vykonateľnú, univerzálne použiteľnú a robustnú.
V laboratóriu sa test PCR skladá z dvoch krokov. V prvom kroku sa existujúci genetický materiál amplifikuje pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). To umožňuje skúmať najmenšie stopy DNA. Aj to je dôvod, prečo PCR testy reagujú tak citlivo.
V druhom kroku sa genetický materiál oddelí podľa jeho vlastností, „roztriedi“ a tým charakterizuje. Inými slovami, je určená jemná štruktúra DNA.
Existuje mnoho možných aplikácií: lekári používajú test PCR napríklad na vyšetrenie sterov na prítomnosť koronavírusov, darovanie krvi na HIV alebo na skríning novorodencov na možné dedičné ochorenia. Bakteriálne infekcie – napríklad patogénom tuberkulózy – alebo parazitárne infekcie (malária) sa dajú objasniť aj pomocou PCR.
Pomáhajú usvedčiť páchateľov aj v súdnom lekárstve na základe ich genetických odtlačkov prstov alebo sa využívajú ako testy otcovstva.
Ako dlho je test PCR platný?
Výsledok testu PCR je zvyčajne platný 48 hodín od odobratia vzorky.
Ako spoľahlivý je test PCR?
PCR je osvedčená metóda detekcie v molekulárnej diagnostike a medicíne. Je považovaný za takzvaný zlatý štandard s veľmi nízkou chybovosťou. Testy sa vyznačujú najmä veľmi vysokou senzitivitou a špecifickosťou.
Citlivosť znamená spoľahlivosť, s akou test nájde genetický materiál, ktorý sa má zistiť.
Špecifickosť znamená istotu, s ktorou test určuje, že daný genetický materiál nie je prítomný vo vzorke.
Kedy fungujú testy PCR na infekciu Sars-CoV-2?
Test PCR odhalí koronavírusovú infekciu spravidla dva až tri dni pred a do 20 dní po nástupe symptómov. Dokonca aj u infikovaných ľudí, ktorí zostávajú úplne bez príznakov, je test účinný v kritickom časovom okne, keď môžu infikovať ostatných.
V individuálnych prípadoch je detekcia možná aj 60 dní po nástupe príznakov.
Možné zdroje chýb
Chybovosť v procese kopírovania DNA je v praxi zanedbateľná. Aj keď DNA polymerázy nie sú nikdy bezchybné, v testovacom postupe PCR sotva zohrávajú úlohu.
V praxi potenciálne zdroje chýb spočívajú skôr v odbere vzoriek: je preto dôležité, aby výtery vykonali vyškolení zdravotníci. Vzorky slín a kloktadla by mohli znížiť presnosť testu, pretože tu dochádza k účinkom riedenia.
Ako funguje test PCR?
Test PCR vykonáva napríklad rodinný lekár alebo v špeciálnych testovacích centrách. Najprv lekári alebo vyškolení zdravotnícki pracovníci odoberú vzorku. Na test sa zvyčajne odoberie tampón z horných dýchacích ciest. Zvyčajne má formu výteru z úst alebo nosohltanu.
Možné je aj kloktanie výplachovým roztokom. Vzorka krvi je atypická na detekciu koróny – ale široko používaná napríklad pri skríningu novorodencov.
Bez ohľadu na typ odobratej vzorky sa genetický materiál nachádza na vatovom tampóne, v oplachovacom roztoku alebo v kvapke krvi. Táto vzorka sa posiela do laboratória, kde sa izoluje a čistí.
Test PCR je potom rozdelený do dvoch krokov:
- PCR: V tomto kroku sa amplifikuje množstvo počiatočného genetického materiálu.
Krok 1: PCR – „polymerázová reťazová reakcia“
„PCR“ je prvým z dvoch krokov: Tu sa amplifikuje množstvo dostupnej východiskovej DNA. Je to preto, že genetický materiál možno analyzovať až vtedy, keď je dostupný v dostatočnom množstve. Vo väčšine prípadov ide o ľudskú DNA; v prípade testov na koronavírus je to vírusová RNA.
Skratka PCR znamená „polymerázová reťazová reakcia“.
Čo je potrebné pre PCR?
Východisková DNA sa umiestni do reakčnej nádoby so špeciálnymi látkami. Existujúci genetický materiál slúži ako templát, ktorý sa skopíruje v prítomnosti určitých enzýmov (Taq polymeráza) a určitých základných stavebných blokov DNA.
Proces kopírovania prebieha v niekoľkých opakujúcich sa chodoch (cykloch).
Konkrétne sa spolu pridávajú tieto látky:
- Počiatočná DNA: Vzorka materiálu, ktorý sa má skopírovať.
- Základné stavebné bloky DNA: Sú to nukleobázy adenín, tymín, cytozín a guanín.
- DNA polymeráza: Enzým, ktorý spája jednotlivé stavebné bloky DNA a vytvára dobre definovaný reťazec DNA. Novo získaný prameň je zrkadlovým obrazom (doplnkom) pôvodného východiskového materiálu.
- Priméry: Pozostávajú zo 16 až 24 párov báz a slúžia ako štartovacia pozícia a štartovací signál. Priméry ukazujú DNA polymerázu, v ktorej polohe (východiskovej DNA) začína proces kopírovania.
Ako sa vykonáva test PCR?
Teraz, keď sú v reakčnej nádobe prítomné všetky látky potrebné pre PCR, môže začať skutočný proces kopírovania genetického materiálu. Toto sa spúšťa, riadi a opäť zastavuje výlučne teplotou.
Reakčná nádoba sa preto postupne zahrieva alebo chladí na rôzne teploty. To sa vykonáva pomocou špeciálneho zariadenia známeho ako termocykler. Celá reakcia trvá približne jednu až dve hodiny.
Jednotlivé kroky cyklu PCR sú
- Denaturácia dvojitých reťazcov DNA: Vzorka sa zahreje na približne 90 stupňov Celzia. Tým sa pôvodný dvojvláknový reťazec DNA rozdelí na dva samostatné (komplementárne) jednoduché reťazce.
- Pripevnenie základných náterov: Teplota sa zníži na mierne pod 60 stupňov Celzia. To spôsobí, že sa priméry (priamy primér, reverzný primér) prichytia na definované pozície na zodpovedajúcich jednotlivých reťazcoch DNA.
Po dokončení cyklu sa teplota opäť zvýši na približne 90 stupňov Celzia – cyklus začína znova od začiatku.
Metódu PCR možno použiť na amplifikáciu sekvencií DNA až do približne troch párov kilobáz (kbp). To zodpovedá približne 3,000 30,000 základným stavebným blokom DNA, ktoré sú navzájom spojené a vytvárajú „reťazec“. Pre porovnanie: ľudský genóm uchováva plány a informácie pre fungovanie bunky v približne troch miliardách párov báz – genóm koronavírusu na druhej strane pozostáva z XNUMX XNUMX párov báz. Test PCR preto môže amplifikovať a skúmať len krátke úseky celkovej DNA.
Rozhodujúce sú priméry
Pre postup PCR je rozhodujúci výber primerov. V diagnostike Sars-CoV-2 sa napríklad používa niekoľko primerov (multiplex PCR).
Corona PCR testy teda hľadajú tri rôzne vírusové gény: To zvyšuje celkovú špecificitu na takmer 99.99 %. To znamená, že pri tejto vysokej úspešnosti pripadá iba jeden falošne pozitívny test na 10,000 XNUMX testov (ak sú vzorky odobraté správne).
Koľko skopírovaného genetického materiálu je teraz k dispozícii?
Predpokladajme, že po prvom cykle sú prítomné dve identické dvojreťazce DNA.
Po každom cykle sa množstvo (skopírovaného) genetického materiálu zdvojnásobí. Množstvo DNA teda rastie exponenciálne.
Lekári zvyčajne opakujú tento proces približne dvadsať až tridsaťkrát.
Obrazne povedané to znamená, že aj keď sa vo vzorke na začiatku nachádza len jedno dvojvlákno DNA, po dvadsiatich cykloch je v reakčnej nádobe už milión identických kópií.
Čo znamená hodnota Ct?
Počet prebehnutých cyklov PCR sa uvádza vo forme takzvanej hodnoty Ct. „Ct“ je odvodené z anglického pojmu „prah cyklu“. Táto hodnota Ct umožňuje robiť vyhlásenia o množstve hľadaného genetického materiálu.
Pri nízkej hodnote Ct 20 je veľa východiskového genetického materiálu. Ak je však hodnota Ct vysoká – okolo 30 cyklov – DNA je zodpovedajúco málo. Cyklus PCR preto musí prebiehať častejšie.
Krok 2: Elektroforéza „Triedenie podľa veľkosti“
Keď je k dispozícii dostatok „obohateného“ genetického materiálu, môže sa uskutočniť elektroforéza. V tomto procese vedci využívajú špecifickú vlastnosť DNA: jej elektrický náboj.
Jednotlivé stavebné bloky DNA sú navzájom spojené cez (záporne) nabitú kostru cukor-fosfát. Čím dlhšia je konkrétna sekvencia DNA, tým vyšší je jej elektrický náboj.
To umožňuje skúmať a charakterizovať genetický materiál. V praxi sa neznáma vzorka zvyčajne vykresľuje oproti známej referencii na „štartovacej čiare“ a po určitom čase sa navzájom porovnáva.
Ak je „rýchlosť migrácie“ rovnaká pre obe sekvencie, znamená to, že detekcia je s najväčšou pravdepodobnosťou pozitívna: Detekcia je veľmi pravdepodobne pozitívna – gén, ktorý hľadáte, je obsiahnutý vo vzorke.
Špeciálny prípad koronavírusu: príprava vzorky a RT-PCR
Detekcia koronavírusu je špeciálny prípad. Sars-CoV-2 patrí medzi takzvané RNA vírusy. To znamená, že genetický materiál Sars-CoV-2 je prítomný vo forme RNA (ribonukleová kyselina).
RNA sa líši od DNA len v niekoľkých ohľadoch. Okrem iného je prítomný ako jeden reťazec a je založený na cukre ribóze namiesto 2′-deoxyribózy. Nukleobáza tymín je tiež nahradená uracilom ako štvrtou bázou.
Táto vírusová RNA musí byť „prepísaná“ do DNA pred pravidelným testom PCR. Tento proces sa nazýva reverzná transkripcia (RT) – odtiaľ termín RT-PCR. V rámci tohto procesu sa získa jedno vlákno cDNA („komplementárna DNA“). V ďalšom kroku je jednovlákno cDNA doplnené druhým vláknom DNA so zrkadlovým obrazom.
Ako dlho trvá dosiahnutie výsledku?
Po odoslaní vzorky do laboratória zvyčajne dostanete výsledok do jedného alebo dvoch pracovných dní. V testovacích centrách, ktoré často skúmajú vzorky priamo na mieste, to môže trvať aj niekoľko hodín. Časové rozpätie závisí vo veľkej miere od príslušného testovacieho centra a jeho logistiky.
Napriek zložitým pracovným procesom sú moderné laboratóriá schopné vykonávať PCR testy s vysokou priepustnosťou. Pri vykonávaní testov pomáhajú špeciálne automatizované zariadenia.
Napriek tomu sa PCR test považuje za pomerne „pomalú“, ale o to spoľahlivejšiu metódu detekcie.
Čo sa stane, ak bude výsledok pozitívny?
Ak je vzorka odobratá správne, pozitívny test PCR znamená, že je veľmi vysoká pravdepodobnosť, že testovaná osoba je infikovaná Sars-CoV-2.
Ak bola u vás potvrdená infekcia koronavírusom pomocou testu PCR, oddelenie verejného zdravotníctva dostane oznámenie o pozitívnom výsledku testu z príslušného laboratória. V takom prípade odbor verejného zdravotníctva nariadi izoláciu alebo karanténu.
Som automaticky nákazlivý, ak mám pozitívny test na PCR?
Zvyčajne áno. Ale nie vždy. Výsledok testu PCR by sa mal vždy interpretovať v kontexte. Pozitívny test v prvom rade znamená, že máte vírusový materiál.
Niekedy je užitočný doplnkový test na protilátky
V takýchto prípadoch poskytuje istotu test na protilátky, ktorý potvrdzuje platnosť testu PCR. Najlepšie je porozprávať sa o tom so svojím lekárom. Môžu vám pomôcť správne interpretovať výsledok testu PCR.
Čo robiť, ak je výsledok negatívny?
Negatívny výsledok testu PCR s najväčšou pravdepodobnosťou znamená, že ste v čase odberu vzorky nemali Covid-19, a preto momentálne nie ste infekční. Môžete však byť v počiatočnej fáze infekcie.
Korónové infekcie sa zvyčajne dajú zistiť až od druhého alebo tretieho dňa po infekcii. Výsledkom teda nie je voľný priechod. Mali by ste preto aj naďalej dodržiavať pravidlá sociálneho odstupu a hygienické pravidlá a naďalej nosiť masku FFP2 – pre vašu vlastnú ochranu a ochranu ostatných.
PCR test pre deti
Test PCR pre deti sa nelíši od testu PCR pre dospelých. Odber vzoriek aj interpretácia výsledkov platí pre deti aj dospelých.
Aké sú riziká testu PCR?
Test PCR nezahŕňa žiadne fyzické riziká. Len odber vzorky výterom z nosohltanu niektorí ľudia vnímajú ako rušivý alebo nepríjemný.
Koľko stojí test PCR?
Upozornenie: Ak ste sa otestovali doma a dostali ste pozitívny výsledok, mali by ste si ihneď telefonicky dohodnúť stretnutie so svojím praktickým lekárom. Váš lekár s vami telefonicky prediskutuje ďalší postup.
Prípadne je najlepšie zavolať na číslo 116 117 a zaregistrovať sa na test PCR. V ideálnom prípade by ste mali zostať doma až do potvrdzovacieho testu, aby ste ochránili seba aj ostatných.
